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當甲氨蝶呤在蛋白質結合位點上被其它藥物所替代時，將產生潛在的藥物毒性的相互作用，這些藥物包括：水楊酸鹽、非甾體類抗炎藥、磺胺、苯妥英。口服抗生素，例如四環素、氯霉素和不能吸收的廣譜抗生素可能通過抑制腸道菌群或通過細菌抑制藥物代謝，從而降低甲氨蝶呤腸道吸收或干擾肝腸循環。
當甲氨蝶呤在蛋白質結合位點上被其它藥物所替代時，將產生潛在的藥物毒性的相互作用，這些藥物包括：水楊酸鹽、非甾體類抗炎藥、磺胺、苯妥英。口服抗生素，例如四環素、氯霉素和不能吸收的廣譜抗生素可能通過抑制腸道菌群或通過細菌抑制藥物代謝，從而降低甲氨蝶呤腸道吸收或干擾肝腸循環。
已有報道，甲氨蝶呤與一些藥物合用能改變細胞對甲氨蝶呤的攝取率，所以病人在接受甲氨蝶呤期間僅能使用腫瘤專家同意的其他藥物，這些藥物包括：琥珀酸氫化可的松、頭孢霉素Ⅰ、甲基強的松龍、門冬酰胺酶、博來霉素、青霉素、卡那霉素、長春新堿和長春花堿。
丙磺舒能減少腎小管的轉運功能，因此，甲氨蝶呤與丙磺舒合用時，應仔細監測。降血脂化合物（例如考來烯胺）與甲氨蝶呤合用時，其結合甲氨蝶呤能力大于血清蛋白。
青霉素和磺胺類藥物可能降低甲氨蝶呤腎清除率，已觀察甲氨蝶呤血清濃度增高并伴有血液學和胃腸道毒性，甲氨蝶呤與青霉素或磺胺類藥合用時應密切觀察。
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